Materiales
Los materiales utilizados en este estudio se exhiben en la tabla. S1.
Cultivo celular
Hep3b, H22 y H22-LUC fueron adquiridos de Rui Man Biotechnology Co., (Guangzhou, China). Hep3B fue cultivado en DMEM, mientras que H22 y H22-LUC se cultivaron en RPMI-1640. Ambos medios se complementaron con suero bovino fetal al 10% (FBS) y al 1% de penicilina-estreptomicina. Los cultivos celulares se mantuvieron en un 37 ° C, 5% de CO2 ambiente humidificado.
Modelo de células calentadas subletalmente
Se preparó un modelo de células expuestas al tratamiento térmico no letal como se describió anteriormente (7). Las células Hep3B fueron plateadas. Después de 24 h, el medio se cambió a un medio precalentado. Luego, las placas se cubrieron con parafilm y se colocaron en un baño de agua ubicado a 44 ° C inmediatamente. Después de someterse a un tratamiento térmico de 15 minutos, las placas se trasladaron a una incubadora de 37 ° C con 5% de CO2 Por un período de 24 h, preparándolos para pasos experimentales posteriores.
Medición de niveles de ROS
Después de someterse a varios tratamientos (CTRL, calor, 100 µg de POM, calor + 100 µg de POM), las células Hep3B se enjuagaron tres veces usando PBS y posteriormente se incubaron en solución DCFH-DA (10 µM) a 37 ° C durante 30 min. Luego se observaron señales de fluorescencia de ROS intracelular empleando el microscopio de fluorescencia (Olympus, GX53) con una longitud de onda de excitación de 460–550 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm.
Las rodajas congeladas del tejido tumoral se incubaron con la sonda DHE durante 1 h, y la señal fluorescente de ROS en los tejidos tumorales se observó bajo el microscopio de fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 535 nm y una longitud de onda de emisión de 610 nm.
Ensayo de formación de colonias
Las células Hep3B se colocaron en placas a una densidad de 1 × 103 Células por pozo en placas de 6 pocillos y agrupadas para diferentes tratamientos (CTRL, calor, 100 µg de POM, calor + 100 µg de POM). Después de un período de incubación de 11 días, las colonias celulares se trataron con paraformaldehído al 4%, luego se tiñeron con violeta cristal, y se enumeró la cantidad de colonias celulares.
Ensayos de migración e invasión
La cámara superior se llena con 8,000 células después de diferentes tratamientos (CTRL, calor, 100 µg de POM, calor + 100 µg de POM) dispersado en medio sin suero 200 µl, mientras que la cámara inferior agregó 600 µl de DMEM que contenía 10% de FBS. Después de 24 h, las células que migraron a la cámara inferior se fijaron en paraformaldehído al 4%, luego se tiñeron con violeta cristal durante 30 minutos y se tomaron imágenes usando un microscopio de fluorescencia invertido con un aumento de 100 ×. La mayoría de los pasos en el ensayo de invasión celular son los mismos que el ensayo de migración celular, excepto que el ensayo de invasión se realiza aplicando 50 µl de matrigel a la membrana Transwell antes del cultivo celular.
Preparación de pom@coa
Primero, se prepararon respectivamente 150 mg/ml de soluciones acuosas de Glu y Lys. La solución turbia CoA acuosa se preparó mezclando en la relación de volumen de Glu: Lys = 1: 1. Después de asentarse o centrifugarse, la solución turbia se separó en una fase acuosa diluida superior y una fase coacervada densa inferior por separación de fase líquido líquido. POM@CoA se prepara mezclando POM con Glu antes de mezclar Glu y Lys en proporción. POM se sintetizó como se describió anteriormente (13).
Caracterización de pom@coa
Pruebas de microscopía electrónica de barrido (SEM): la morfología de la superficie y la estructura del andamio de las muestras liofilizadas (COA y POM@CoA) se escanearon utilizando el SEM (Phenom Scientific, Phenom Pure). Pruebas de infrarrojos de transformación de Fourier (FTIR): los grupos carboxilo y amino de las muestras (Glu, Lys y COA) se detectaron utilizando FTIR para verificar que el mecanismo de reticulación de COA es principalmente a través de la interacción electrostática. Pruebas mecánicas: la viscoelasticidad dinámica de COA y POM@COA se evaluó utilizando un reómetro (Thermo Fisher, Haake Mars40) equipado con una placa paralela de acero de 60 mm de diámetro. Las pruebas de corte oscilatoria se realizaron con una tensión constante de 1.0% y una frecuencia de 3.14 rad/s a una temperatura de 25 ° C dentro de una solución PBS. Pruebas de fuerza de inyección: la fuerza requerida para inyectar COA o POM@CoA se determinó insertando el materials en una jeringa de 1 ml que se aseguró en un dispositivo de prueba de presión (Sumspring, CCY-02). La fuerza de inyección se registró en una velocidad de avance establecida y distancia.
Carga y liberación de POM por Pom@COA Analysis
POM@CoA con diferentes concentraciones de POM (5, 10 y 20 mg/ml) se prepararon como se describió previamente. La eficiencia de encapsulación (EE) de POM se calculó midiendo la absorbancia de la POM no encapsulada en el sobrenadante usando un espectrofotómetro. El EE se outline como:
$$ : ee : = : frac {{q} _ {complete}-{q} _ {descarado}} {{q} _ {tatol}} : instances : 100 %$$
Qcomplete significa la cantidad complete de POM en la suspensión y Qdescargado significa la cantidad de POM no encapsulado.
Después de que se preparó 5 mg/ml de POM@CoA, el sobrenadante fue reemplazado por volúmenes iguales de PBS frescos con diferentes pH (pH 7,4, 6,5, 5,0). La liberación complete de POM se determinó monitoreando la absorbancia de POM en PBS en varios intervalos de tiempo utilizando un espectrofotómetro.
Imagen fotoacústica
Evaluación de la administración inumoral de fármacos de POM@COA, ratones con HCC inyectados intratumoralmente con 30 µl de POM@COA (POM 5 mg/ml) se tomaron imágenes mediante un sistema de imágenes fotoacústicas ultrasonadas (Fujifilm, Vevo LAZR-X). Reconstruya y superponga las imágenes ultrasónicas y fotoacústicas para un análisis posterior.
Prueba de biocompatibilidad para COA
El ensayo de toxicidad de la proliferación celular se adoptó para detectar la biocompatibilidad de COA. Brevemente, las células Hep3B se colocaron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 × 103 células por pozo y izquierda durante 24 h. Luego fueron tratados con varias concentraciones de COA durante 24 h adicionales. Después de eso, las células se incubaron con un medio de cultivo que contenía al 10% de la solución Package-8 (Dojindo, CCK-8) durante 1 h. Un lector de placas (Perkinelmer, visualización) midió la absorbancia a 450 nm, y la viabilidad celular se determinó posteriormente.
Animales y modelos de tumores
El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Quinto Hospital Afiliado de la Universidad Solar Yat-Sen aprobó los protocolos de estudio de animales. Se obtuvieron ratones C57BL/6 (hembras, 6–8 semanas) del Guangdong Jinwei Organic Co., Ltd, y se mantuvieron en el Laboratorio de Animales SPF.
Para crear un modelo de tumor subcutáneo residual IRFA, 1 × 106 Las células H22 se inyectaron subcutáneamente en el muslo lateral de ratones C57BL/6. Para establecer el modelo de metástasis hepática, 2 × 106 Las células H22-LUC se inyectaron en el bazo de ratones, lo que permitió que las células viajen a través de las venas esplénicas y portal de regreso al hígado, lo que lleva a la formación de metástasis hepáticas. El modelo subcutáneo del tumor IRFA se estableció como se describió el estudio anterior (12). El tamaño del tumor y el peso de los ratones se midieron cada 2 días después del tratamiento. El volumen del tumor se documentó utilizando la fórmula: volumen = (ancho2 × longitud)/2.
Una vez que el volumen del tumor subcutáneo alcanzó los 100 mm3 Asignado a cuatro grupos para evaluar la efectividad de Pom@CoA. Se inyectaron 30 µl de volúmenes de PBS, COA, POM y POM@COA en los tumores residuales de ratones una vez por semana durante un complete de 3 veces. La concentración de POM fue de 5 mg/ml. Las metástasis hepáticas fueron monitoreadas mediante el uso de un sistema de imágenes in vivo (Perkinelmer, Ivis Lumina III) semanalmente. El tamaño del tumor y el peso de los ratones se midieron cada 2 días después del tratamiento. Todos los ratones fueron sacrificados después de tres semanas, se recolectaron tumores para el análisis de la detección de niveles de ROS y la citometría de flujo, y los tejidos hepáticos se tiñeron con H&E para la validación de metástasis e inmunohistoquímica.
Citometría de flujo y preparación de muestras
Los ratones fueron sacrificados y los tumores fueron recolectados. Los tumores se enjuagaron con PBS, se picaron en pequeños fragmentos y se trataron con una solución de digestión que contiene colagenasa durante 30 minutos. Después de la digestión, los tejidos se procesaron en suspensiones de células únicas utilizando un disociador (Miltenyi Biotec, Gentlemacs) y se pasaron a través de un filtro de células de 70 micrones para eliminar cualquier escombro de tejido restante. Posteriormente, se aplicó un cóctel de anticuerpos marcados con fluorocromo para el marcado de fluorescencia de la siguiente manera: APC Anti-Mouse CD3 (Biolegend, 100236), Percp Anti-Mouse CD45 (Biolegend, 103130), FITC Anti-Mouse CD4 (Biolegend, 100406),, y), PE/Cyanine7 anti-ratón CD8A (Biolegend, 100722), Alexa Fluor® 700 CD11B anti-ratón/humano (Biolegend, 101222), APC Anti-Mouse F4/80 (Biolegend, 123116), PE/DazzleTM594-Anti-CD86 (Biolegend, 105042), PE Anti-Mouse CD206 (MMR) (Biolegend, 141706), PE anti-Humana/Granzima de ratón B Recombinante (Biolegend, 372208), Violeta brillante 421 Anti-Mouse IFN-γ (( Biolegend, 505830), PE/Dazzle ™ 594 TNF-α anti-ratón (Biolegend, 506346). El análisis celular se realizó utilizando el citómetro de flujo Cytoflex, y el análisis de datos se realizó con el software program CytExpert de Beckman, EE. UU. Se utilizó un enfoque de activación paso a paso para distinguir entre varias poblaciones celulares.
Tinción de H&E y tinción de inmunohistoquímica
La tinción de H&E y la tinción de inmunohistoquímica se realizaron en estudios anteriores (19). Después de tomar fotos bajo un microscopio, usó el software program Picture J (NIH, EE. UU.) Para contar el área de la metástasis hepática en un campo de visión. Para la tinción de inmunohistoquímica, las secciones de tejido se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios (anti-CD8α, CST, 98941 s; Vimentin, CST, D21H3; E-cadherina, CST, 24E10; N-cadherina, CST, D4R1H) a 4 ° C y luego incubado con anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 1 h. Las diapositivas se escanearon y digitalizaron en última instancia utilizando un sistema de escáner de portaobjetos (3Dhistech Ltd, Flash P250).
Evaluación de toxicidad in vivo
Después de diferentes tratamientos, todos los ratones fueron sacrificados por CO2 La inhalación, y sus órganos y sangre se cosecharon entre los grupos. Para evaluar los cambios histopatológicos, se mancharon los órganos, incluidos el corazón, el bazo, el pulmón y los riñones. Luego se analizaron los datos de sangre recopilados de las cohortes.
Análisis estadístico
Los datos se realizaron con GraphPad Prism 8.0, presentando datos numéricos como la media ± desviación estándar (DE). Los métodos estadísticos empleados incluyeron el no apartado de dos colas T-test, análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con un pag-Shressue umbral de P P P
